Estudio de la capacidad antifúngica de levaduras del kefir y su potencial como agente de biocontrol en maíz

Abstract

El kefir es una bebida fermentada que contiene microrganismos probióticos, la cual se obtiene colocando gránulos de kefir en un sustrato adecuado. Los gránulos de kefir son un consorcio de bacterias y levaduras inmersas en una matriz de exopolisacáridos. El objetivo de esta investigación fue el aislamiento e identificación de levaduras a partir de kefir de diferente origen para la evaluación de la capacidad antifúngica frente a Aspergillus spp. y Fusarium graminearum, y la caracterización de rasgos relacionados con la virulencia, con el fin de una posible aplicación en maíz. Usando RFLP de la región ITS1/ITS2 y genes específicos, secuenciación de la región D1/D2 y técnicas RAPD, se identificaron 25 aislamientos del kefir como Geotrichum candidum, Pichia kudriavzevii, P. membranifaciens, Saccharomyces cerevisiae, Candida ethanolica y C. boidinii. Se evaluó su capacidad antifúngica por la reducción de la germinación de conidios, lo que permitió seleccionar ocho aislados con alta a moderada reducción de la germinación de conidios frente a A. flavus y A. parasiticus. Además, estos aislados seleccionados mostraron inhibición del crecimiento por contacto en el ensayo de cultivo dual para ambas especies de Aspergillus y de F. graminearum y 3 de ellos ‒pertenecientes a las especies S. cerevisiae y P. kudriavzevii‒ generaron compuestos orgánicos volátiles que afectaron significativamente el crecimiento de los hongos. Adicionalmente se observó un efecto sobre la producción de deoxinivalenol por parte de F. graminearum al ser coincubados en medio PDA en placas de Petri y se determinó la capacidad de capturar aflatoxina B1 en buffer PBS. Para la evaluación de los rasgos relacionados con la virulencia, se analizó el crecimiento a altas temperaturas, las actividades enzimáticas, la resistencia al pasaje gastrointestinal simulado y la adhesión a células Caco-2. Los aislamientos no presentaron más de un rasgo positivo relacionado con la virulencia simultáneamente. En particular, es importante resaltar que la capacidad de adhesión al modelo de barrera intestinal fue extremadamente baja para todos ellos. De acuerdo con los resultados obtenidos, se procedió con el estudio de la actividad antifúngica contra A. flavus de los aislamientos aplicados a maíz molido en condiciones de minisilo. En donde se evidenció que los aislamientos pertenecientes a G. candidum y S. cerevisiae tuvieron un efecto sobre el crecimiento del hongo filamentoso, de acuerdo al recuento en placa y PCR cuantitativa, y sobre la producción de aflatoxinas. Por otro lado, cuando se empleó el kefir de agua entero se obtuvo un mayor efecto antifúngico. Cabe destacar la importancia del estudio del comportamiento de los aislamientos individuales que conforman el consorcio, dado que la variabilidad inherente al mismo complejiza su aplicación como agente de biocontrol.

Kefir is a fermented drink which contains probiotic microorganisms, it is obtained by placing kefir granules in a suitable substrate. The kefir granules are a consortium of bacteria and yeasts embedded in a exopolysaccharide matrix. The aim of this research was the isolation and identification of yeasts from kefir of different origin, the evaluation of their antifungal capacity against Aspergillus spp. and Fusarium graminearum, and the characterization of virulence related traits, with the final purpose of a possible application in corn. Using RFLP of ITS1/ITS4 region, D1/D2 region sequencing and RAPD techniques, 25 kefir isolates were identified as Geotrichum candidum, Pichia kudriavzevii, P. membranifaciens, Saccharomyces cerevisiae, Candida ethanolica and C. boidinii. Their antifungal capacity was evaluated by their conidia germination reduction, which allowed the selection of eight isolates with high to moderate conidia germination reduction against A. flavus and A. parasiticus. Furthermore, these selected isolates showed growth inhibition on contact in the dual culture assay for both Aspergillus and Fusarium species and 3 of them ‒belonging to S. cerevisiae and P. kudriavzevii species‒ generated volatile organic compounds which significantly affected fungal growth. Additionally, an effect on deoxynivalenol production by F. graminearum was observed when coincubated in PDA medium in Petri dishes, and the aflatoxin B1 binding ability in PBS buffer was determined. For the evaluation of virulence related traits, growth at high temperatures, enzymatic activities, survival to simulated gastrointestinal tract conditions and the adhesion to Caco-2 cells were analyzed. The isolates did not present more than one positive virulence-related trait simultaneously. In particular, it is important to highlight that the adhesion capacity to the model of intestinal barrier was extremely low for all of them. According to the results obtained, the study of the antifungal activity against A. flavus of the isolates applied to corn under minisilo conditions was conducted. Where it was evidenced that the isolates belonging to G. candidum and S. cerevisiae had an effect on the growth of the filamentous fungus, detected by means of plate counting and quantitative PCR, and on the production of aflatoxins. On the other hand, when whole water kefir was used, a greater antifungal effect was obtained. It is worth noting the importance of studying the behavior of the individual isolates which conformed the consortium, as its inherent variability makes its application as a biocontrol agent more complex.