Puesta a punto del proceso de expansión de células derivadas de tejidos dentales

Abstract

La presencia de células madre (CM) en tejidos dentales abrió nuevas líneas de investigación en el área de la odontología regenerativa. Los objetivos de este trabajo fueron poner a punto el método de obtención, aislamiento y expansión de CM derivadas de tejidos dentales y caracterizarlas. Se utilizaron terceros molares cuyas pulpas y saco periodontal se procesaron de la siguiente manera: 1) digestión enzimática; 2) obtención de explantes. En ambos casos, se cultivaron en DMEM suplementado. Las células fueron caracterizadas en el estadio P2 (pasaje 2) mediante el estudio de marcadores de superficie específicos de CM (CD73, CD90 y CD105) por citometría de flujo, obteniéndose porcentajes similares en ambos tratamientos: CD73 99.2%; CD90 85.5% y CD105 62.01%. Previo al procesamiento, se observó morfológicamente la pulpa dental mediante MET, destacándose la presencia de células de morfología variable, con signos que indican una intensa actividad metabólica. Se evidencian mitocondrias en todas las células, gran cantidad de vesículas y gránulos de secreción. Las células cultivadas fueron analizadas mediante microscopía con contraste de fases, y se observó la formación de numerosas colonias de células fusiformes y estrelladas, formando agregados en forma irradiada, paralelas unas a otras. Para el tratamiento 1, se alcanzó confluencia celular luego de 21 días de cultivo. En cambio, para el tratamiento 2 el crecimiento fue más rápido y se alcanzó el estado de semiconfluencia a los 14 días. Con estos resultados preliminares podemos concluir que el explante es el mejor método para obtener CM mesenquimales derivadas de los tejidos dentales, ya que se obtiene mayor número de células en menor tiempo, lo que es coincidente con la bibliografía publicada al respecto. Además, la morfología celular es un buen indicador de calidad y desarrollo del cultivo, pudiendo utilizarse como control de calidad biológico en este tipo de procedimientos.

The presence of stem cellsln dental tissues opened new lines of research In the regenerative dentistry area. The objectives of this work were to develop and characterize a method for obtaining, isolating and expanding dental tissues derived stem cells. Third molars were used, which pulps and periodontal sac were processed using one of these two methods: 1) enzymatic digestion 2) explants. In both cases, the obtained cells were cultured in supplemented DMEM. The cells were characterized In stage P2 (passage 2) by studying specific surface markers of stem cells(CD73, CD90 and CD105) by flow cytometry, obtaining similar percentages in both treatments: CD73 99.2%; CD90 85.5% and CD105 62.01%. Prior to processing, dental pulp was morphologically analyzed by MET, highlighting the presence of cells with variable morphology, with signs Indicating Intense metabolic activity. Mitochondria, large amount of vesicles and secretion granulesare evidenced in all cells. Cultured cells were analyzed through contrast phase microscopy, the formation of numerous spindle and stellate cells colonies were observed, forming aggregates In irradiated form, parallel to one another. For treatment 1, cell confluence was reached after 21 days of culture. On the other hand, for treatment 2, the growth was faster and the state of semi confluence was reached after 14 days. With these preliminary results we can conclude that the explant is the best method to obtain stem cells derived from dental tissues, since a greater number of cells Is obtained in less time, which coincides with the published literature. In addition, cell morphology Is a good Indicator of culture quality and development, and can be used as a biological quality control in this type of procedure.