Evaluación de un método colorimétrico para el estudio de la interacción entre micoorganismos y células de epitelio intestinal

Abstract

El objetivo del presente trabajo fue evaluar la aplicabilidad de la determinación colorimetries de la actividad nitrato reductasa microbiana para estudiar la asociación de microrganismos con enterocitos humanos en cultivo (linea Caco-2). El nitrito producido luego de la incubación de las suspensiones bacterianas con una solución de nitrato- formiato fue evaluado mediante una reacción de diazotación-copulación con ácido sulfanílico y cloruro de N-naftil- etilen diamonio. Se observó una relación bifásica entre la concentración bacteriana y la concentración de nitrito producida. Esta respuesta particular podría ser atribuida al carácter sigmoideo de la cinética de reducción de nitrato y hace que sea necesaria la modificación de los métodos de cálculo. La asociación bacteriana con células Caco-2 se mostró dependiente de la cepa encontrándose los mayores valores para Staphylococcus aureus ATCC 25923. Para algunas cepas, los porcentajes de asociación calculados en base a la actividad nitrato-reductasa fueron significativamente mayores que los calculados en base a recuentos de microorganismos viables. Los resultados del presente trabajo muestran que la asociación de microorganismos con enterocitos humanos en cultivo puede ser evaluada a través do la medición de la actividad nitrato reductásica, siempre que para los cálculos se tengan en cuenta la relación bifásica entre la concentración bacteriana y la concentración de nitrito.

Colorimetric method to evaluate the Interaction between microorganisms and cultured human enterocytes. The aim of the present study was to gain further insight on the reliability of the colorimetric determination of the activity of bacterial nitrate reductase to evaluate bacterial concentrations and interaction between microorganisms and enterocyte-like cells. Nitrite produced after incubation of the samples with a nitrate-formate solution was determined with a diazotization reaction with sulphanilic acid and N-naphthyl-ethylene-diamonium dichloride. Cell association assays were performed with differentiated Caco-2 cells. A biphasic relationship was found between nitrite concentration and bacterial densities. This behavior seems to be due to the sigmoideal character of the kinetics of nitrate reduction. Association to Caco-2 cells was strongly strain dependent being Staphylococcus aureus ATCC 25923 the strain showing the highest values of association. For some strains, percentages of association calculated on the basis of the colorimetric assay were significantly higher than those calculated in terms of viable counts. Bacterial association with enterocyte-like cells can be evaluated by measures of the activity of bacterial nitrate reductase provided that the biphasic relationship between bacterial and nitrite concentrations is taken into account for the calculations. Results presented in this paper show the applicability of the colorimetric method to assess the amount of microorganisms associated to human enterocytes in culture.